猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和轮状病毒肠炎是猪的高度接触性肠道传染病，多发生于冬春季节，呈地方性流行或散发。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PＲV)等病原可通过带毒母猪胎盘和乳汁传播给仔猪，也可通过仔猪间的直接接触经消化道和呼吸道传播。猪致病性大肠杆菌可引起仔猪黄痢、白痢和水肿病。在临床诊断过程中，这些引起仔猪腹泻的病原不易区分。上述三种病毒间可呈现混合感染，或与致病性大肠杆菌混合感染，能引起10日龄以内的仔猪严重脱水，死亡率高(平均50%左右，最高可达%)。年12月份以来，鄂西北地区多家猪场仔猪出现水样腹泻、呕吐和迅速脱水等传染病，抗生素治疗效果差。为查找病因，笔者近期对本地区发生严重腹泻的26家规模化猪场饲养的猪群进行临床观察、病理剖检和实验室诊断，确定本次仔猪腹泻的主要病原是流行性腹泻病毒，并提出了可行的应对措施。
1材料与方法1．1主要试剂及培养基TGEV、PEDV、PＲVqＲT－PCＲ检测试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;M．Ｒ．试剂、V－P试剂、微量生化发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司;猪胆盐、牛肉膏、蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;革兰染液、麦康凯培养基、1%蛋白胨培养基、靛基质试剂、三糖铁琼脂培养基、硫化氢试验培养基，自制。1．2病料无菌采集典型腹泻仔猪脏器和肠腔内新鲜粪样，3h内进行细菌分离和病毒检测。1．3流行病学调查调查发病猪群的免疫情况、仔猪腹泻流行规律和死亡率。1．4临床观察对腹泻仔猪精神状态、粪便颜色和质地、体表特征以及体温等临床特征进行详细观察记录。向养殖场有关技术人员询问病死猪死前的一些临床表现。1．5病理剖检对病死猪进行剖检，重点观察肩前淋巴结、腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结的外观和质地，心脏、肝脏、脾脏、肾脏的外观和质地，小肠和大肠的肠壁病变和肠内容物的特征。1．6细菌学鉴定1．6．1细菌的分离纯化将无菌采集的病料接种于巧克力培养基和麦康凯培养基，37℃培养18～24h，观察细菌生长情况、菌落特征，并对可疑菌落进行染色、镜检、纯化和菌种保存。1．6．2生化鉴定对所有分离的菌株进行生化试验，具体操作参照参考文献［1］进行。1．6．3动物试验为了鉴定所分离的菌株是否具有致病性，使用小白鼠进行动物回归试验。每次试验选用20只16～20g健康昆明系小白鼠(购自襄阳职业技术学院医学院)，随机分为对照组和试验组。将纯化菌株接种于普通营养琼脂培养基培养18～20h;用无菌生理盐水洗下制成菌悬液(约20×～50×个/mL)，再将菌悬液腹腔注射健康小白鼠(0．5mL/只)，隔离饲养，观察小白鼠的发病死亡情况。剖检小白鼠，取病变明显的组织接种于巧克力培养基和麦康凯培养基，37℃培养18h，挑取可疑菌落进行染色、镜检、生化鉴定，观察是否为接种菌株。1．7病毒学鉴定1．7．1样本的采集对新发生腹泻的仔猪，使用一次性无菌注射器，吸取无污染新鲜粪便2mL;对因腹泻脱水死亡猪只进行解剖，取肿胀肠系膜淋巴结2g，或取半透明充胀小肠肠段3cm，两端结扎。所采样本均装入无菌自封袋，标号后冷藏，待检。1．7．2样本的处理组织样品的处理:分别从肠系膜淋巴结的3个不同位置取样，或剪取肠段，称取样品约1g，用手术剪剪碎，混匀，再取0．05g于研磨器中研磨，加入1．5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1．5mL灭菌离心管中，r/min离心2min;取上清液μL于1．5mL灭菌离心管中，用于病毒ＲNA的提取。粪便样品的处理:取约0．05g粪便于1．5mL灭菌离心管中，加入1mL生理盐水涡旋振荡，r/min离心2min，取上清液μL于1．5mL灭菌离心管中，用于病毒ＲNA的提取。1．7．3病毒实时荧光ＲT－PCＲ(qＲT－PCＲ)的检测按照PEDV、PＲV、TGEVqＲT－PCＲ检测试剂盒的操作规程进行病毒ＲNA的提取和qＲT－PCＲ扩增检测。1．7．4结果判定如阳性对照Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立;被检样品若FAM荧光信号Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，为TGEV阳性;若被检样品VIC荧光信号Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，为PEDV阳性;若被检样品LIZ荧光信号Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，为PＲV－A阳性;被检样品36＜Ct≤38并出现特定的扩增曲线，需重新再做一次，如两次结果相同，则判定为阳性;被检样品Ct值＞38时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性。
2结果2．1流行特点调查的26家猪场均存栏经产母猪头以上，母猪群均在10月份一次接种2头份国产流行性腹泻和传染性胃肠炎二联疫苗，猪瘟、伪狂犬病、圆环病毒病等常规疫苗按计划进行免疫。调查的规模化猪场仔猪在11月份开始陆续发病，不同猪场仔猪腹泻发病时间长短不一，持续时间短的为20d，长的为4个月或以上，部分猪场呈现间歇式发病。发病猪场的整栋产仔舍仔猪发生腹泻窝数一般为当月生产窝数的30%～60%，呈跳跃式散发。各产仔舍的仔猪发生腹泻时，窝内传播速度很快，最初的第1只猪发病后12h内即会导致全窝发病。不同生长阶段的猪只均有发病，日龄越小影响越大，1周内新生仔猪发病症状严重，腹泻2～3d就会呈现严重脱水而死亡，死亡率可达50%，最高的死亡率为%。少数仔猪恢复后生长不良。断奶猪、母猪和中大猪常呈现精神萎顿、厌食、持续性腹泻和部分猪只呕吐，大约持续3～7d会自行康复。2．2临床症状发病猪只的主要临床症状为水样腹泻，粪便呈现水泥浆样，初为灰色或灰黄色，迅速转为血性水痢，粪便中混有脱落的肠黏膜或纤维素性渗出物，异常腥臭。部分腹泻仔猪采食教槽料或猪奶后，会出现呕吐症状。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。持续性的腹泻会导致营养吸收不良，猪只吮吸力下降，大大加重新生仔猪的病情。2．3病理变化病死猪脱水、消瘦，皮肤干燥、无弹性。解剖可见胃内充满未消化的黄白色乳凝块，小肠扩张，外观明亮，肠壁变薄;肠管内充满黄色液体或充气;小肠黏膜、肠系膜水肿、充血，个别发病仔猪小肠黏膜有轻度点状出血;大肠和盲肠段肠黏膜水肿、出血、坏死，表面附着胶胨状炎症渗出物;肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结出血、肿胀，颜色发紫。其他实质性器官未见肉眼病变。
2．4实验室诊断结果通过细菌学鉴定，部分猪只腹泻病原为致病性大肠杆菌。通过qＲT－PCＲ检测，部分猪只腹泻病原为流行性腹泻病毒。另外，有相当一部分仔猪体内同时分离到致病性大肠杆菌和流行性腹泻病毒。由表1可知:19家猪场流行性腹泻病毒检测结果阳性，阳性率为73．08%。其中16家猪场仔猪为猪流行性腹泻病毒并发感染致病性大肠杆菌，占61．54%;3家猪场仔猪仅为流行性腹泻病毒感染，占11．54%;7家猪场仔猪腹泻仅为致病性大肠杆菌所致，比例为26．92%;26家猪场传染性胃肠炎病毒和轮状检测结果均为阴性。由此可见，本次送检26家规模化猪场发生腹泻的主要病原为PEDV，且相当一部分猪场仔猪并发感染致病性大肠杆菌，部分猪场仅为致病性大肠杆菌引起猪只腹泻。
3讨论试验结果表明，引起鄂西北地区规模化猪场仔猪腹泻的病原为PEDV。同时发现，PEDV在该地区通常与致病性大肠杆菌混合感染，引起仔猪的高死亡率。自从PEDV于年首次在英格兰被发现来，人们陆续在亚洲和欧洲许多发生腹泻的规模化猪场分离到PEDV。自年来，我国相继报道有流行性腹泻的发生。张世忠等的试验结果表明:福建省规模化猪场年PEDV感染阳性率为52．2%;在调查的96例病例中，76．0%分布于冬春季(11月份至次年3月份)，19．8%分布于春末夏初(4—6月份)，个别发生于炎热夏季(如7月，10月份)。刘孝珍等报道了在年从新疆、黑龙江、北京、山东、河南、上海、福建、广东和广西等分离到PEDV，与国内以前报道的基因型存在差异，病毒发生了变异。这些原因导致许多厂家生产的疫苗免疫效果不理想，流行性腹泻的防控形势严峻。因此，加强本地区适应性流行性腹泻疫苗的研制和科学合理免疫程序的制订意义重大。
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